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PCR技術基本原理

PCR技術基本原理 | 時間: December-16 12:56:58 | 分類:技術欄目

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     PCR技術的基本原理 類似于DNA的天然復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;③引物的延伸:DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。
PCR的反應動力學  PCR的三個反應步驟反復進行,使DNA擴增量呈指數上升。反應較終的DNA 擴增量可用Y=(1+X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數,X表示平(Y)均每次的擴增效率,n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%,但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期,靶序列DNA片段的增加呈指數形式,隨著PCR產物的逐漸積累,被擴增的DNA片段不再呈指數增加,而進入線性增長期或靜止期,即出現“停滯效應”,這種效應稱平臺期數、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素。大多數情況下,平臺期的到來是不可避免的。

PCR反應體系的基本成分:模板DNA、特異性引物、DNA聚合酶、dNTP、 Mg2+的緩沖液。
 

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