蛋白質檢測：蛋白質印跡法
蛋白質檢測：蛋白質印跡法 | 時間: December-7 11:17:56 | 分類:技術欄目
凌儀生物專業提供高速離心機，美國Bio-rad伯樂電泳儀，德國eppendorf艾本德移液器，PCR基因擴增儀，雅培原位雜交儀，Thermo熱電離心機等實驗室儀器設備，要省錢，別錯過哦。蛋白質檢測：蛋白質印跡法與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。
1把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質電泳轉移到硝酸纖維膜上。
1）轉移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預先用轉移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。
4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉移緩沖液以淹沒凝膠。
5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉移。
6）轉移結束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。2將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標準顯現時取出，記錄下標準位置。
3用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。
4膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時。
5室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
6用封口機將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。
7袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。
8混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下搖動2小時（或4℃過夜）
9用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。
10將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內，于室溫下搖動1小時。
11按步驟9洗滌。
12加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下搖動1小時。
13按步驟9洗滌。
14配制顯色指示劑/底物：混合顯色指示劑原液3.0ml，PBS 9.0ml，加入1%過氧化氫150.0微升。立即使用。
15于室溫下搖動直至出現紫色并開始看到背景（1~10分鐘）。
16將薄膜轉到另一盛水容器中洗滌，終止顯色反應，空氣干燥，封入塑料袋中避光保存。
