蛋白質提取與制備蛋白質種類很多，性質上的差異很大，既或是同類蛋白質，因選用材料不同，使用方法差別也很大，且又處于不同的體系中，因此不可能有一個固定的程序適用各類蛋白質的分離。但多數分離工作中的關鍵部分基本手段還是共同的，大部分蛋白質均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數與脂類結合的蛋白質溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機溶劑中。因此可采用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質和酶。蛋白質與酶在不同溶劑中溶解度的差異，主要取決于蛋白分子中非極性疏水基團與極性親水基團的比例，其次取決于這些基團的排列和偶極矩。故分子結構性質是不同蛋白質溶解差異的內因。溫度、pH、離子強度等是影響蛋白質溶解度的外界條件。提取蛋白質時常根據這些內外因素綜合加以利用。將細胞內蛋白質提取出來。并與其它不需要的物質分開。但動物材料中的蛋白質有些可溶性的形式存在于體液（如血漿、消化硫等）中，可以不必經過提取直接進行分離。蛋白質中的角蛋白、膠原及絲蛋白等不溶性蛋白質，只需要適當的溶劑洗去可溶性的伴隨物，如脂類、糖類以及其他可溶性蛋白質，較后剩下的就是不溶性蛋白質。這些蛋白質經細胞破碎后，用水、稀鹽酸及緩沖液等適當溶劑，將蛋白質溶解出來，再用離心法除去不溶物，即得粗提取液。水適用于白蛋白類蛋白質的抽提。如果抽提物的pH 用適當緩沖液控制時，共穩定性及溶解度均能增加。如球蛋白類能溶于稀鹽溶液中，脂蛋白可用稀的去垢劑溶液如十二烷基硫酸鈉、洋地黃皂苷（Digitonin)溶液或有機溶劑來抽提。其它不溶于水的蛋白質通常用稀堿溶液抽提。
1.1蛋白質提取與制備概述
蛋白質的制備是一項十分細致的工作。涉及物理學、化學和生物學的知識很廣。近年來雖有了不少改進，但其主要原理仍不外乎兩個方面：一是利用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配于可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析、有機溶劑提取、層析和結晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于不同區域而達到分離的目的，如電泳、超離心、超濾等。由于蛋白質不能溶化，也不能蒸發，所能分配的物相只限于固相和液相，并在這兩相間互相交替進行分離純化。制備方法可按照分子大小、形狀、帶電性質及溶解度等主要因素進行分類。按分子大小和形態分為差速離心、超濾、分子篩及透析等方法；按溶解度分為鹽析、溶劑抽提、分配層析、逆流分配及結晶等方法；按電荷差異分為電泳、電滲析、等電點沉淀、離子交換層析及吸附層析等；按生物功能專一性有親合層析法等。
由于不同生物大分子結構及理化性質不同，分離方法也不一樣。即同一類生物大分子由于選用材料不同，使用方法差別也很大。因此很難有一個統一標準的方法對任何蛋白質均可循用。因此實驗前應進行充分調查研究，查閱有關文獻資料，對欲分離提純物質的物理、化學及生物學性質先有一定了解，然后再著手進行實驗工作。對于一個未知結構及性質的試樣進行創造性的分離提純時，更需要經過各種方法比較和摸索，才能找到一些工作規律和獲得預期結果。其次在分離提純工作前，常須建立相應的分析鑒定方法，以正確指導整個分離純化工作的順利進行。高度提純某一生物大分子，一般要經過多種方法、步驟及不斷變換各種外界條件才能達到目的。因此，整個實驗過程方法的優劣，選擇條件效果的好壞，均須通過分析鑒定來判明。
另一方面，蛋白質常以與其他生物體物質結合形式存在，因此也易與這些物質結合，這給分離精制帶來了困難。如極微量的金屬和糖對巨大蛋白質的穩定性起決定作用，若被除去則不穩定的蛋白質結晶化的難度也隨之增加。如高峰淀粉酶A 的Ca2+，胰島素Zn2+等。此外，高分子蛋白質具有一定的立體構象，相當不穩定，如前所述極易變性、變構，因此限制了分離精制的方法。通常是根據具體對象聯用各種方法。為得到天然狀態的蛋白質，盡量采用溫和的手段，如中性、低溫、避免起泡等，并還要注意防腐。注意共存成分的影響。如蝮蛇粗毒的蛋白質水解酶活性很高，在分離純化中需引起重視。純化蝮蛇神經毒素時，當室溫超過20℃時，幾乎得不到神經毒素。蝮蛇毒中的蛋白水解酶能被0.1mol/L EDTA 完全抑制，因此在進行柱層析前先將粗毒素0.1mol/LEDTA 溶液處理，即使在室溫高于20℃，仍能很好的得到神經毒素。整個制備過程一般可分為5 個階段：①材料的選擇和預處理，②細胞的破碎（有時需進行細胞器的分離），③提取，④純化（包括鹽析，有機溶劑沉淀，有機溶劑提取、吸附、層析、超離心及結晶等），⑤濃縮、干燥及保存。以上5 個階段不是要求每個方案都完整地具備，也不是每一階段截然分開。不論是哪一階段使用哪一種方法，均必須在操作中保存生物大分子結構的完整性。保存活性防止變性及降解現象的發生。因空間結構主要依靠氫鍵、鹽鍵和范德華力的存在，遇酸、遇堿、高溫、劇烈的機械作用及強烈的輻射等均可導致活性喪失。因此選擇的條件應為十分溫和。同時應注意防止系統中重金屬離子、細胞自身酶系及其他有毒物質的污染。
1.2蛋白質提取與制備具體操作方法
1.2.1原料的選擇
早年為了研究的方便，盡量尋找含某種蛋白質豐富的器官從中提取蛋白質。但至目前經常遇到的多是含量低的器官或組織且量也很小，如下丘腦、松果體、細胞膜或內膜等原材料，因而對提取要求更復雜一些。原料的選擇主要依據實驗目的定。從工業生產角度考慮，注意選含量高、來源豐富及成本低的原料。盡量要新鮮原料。但有時這幾方面不同時具備。含量豐富但來源困難，或含量來源均理想，但分離純化操作繁瑣，反而不如含量略低些易于獲得純品者。一般要注意種屬的關系，如鰹的心肌細胞色素C 較馬的易結晶，馬的血紅蛋白較牛的易結晶。要事前調查制備的難易情況。若利用蛋白質的活性，對原料的種屬應幾乎無影響。如利用胰蛋白酶水解蛋白質的活性，用豬或牛胰臟均可。但若研究蛋白質自身的性質及結構時，原料的來源種屬必須一定。研究由于病態引起的特殊蛋白質（本斯.瓊斯氏蛋白、貧血血紅蛋白）時，不但使用種屬一定的原料，而且要取自同一個體的原料。可能時盡量用全年均可采到的原料。對動物生理狀態間的差異（如饑餓時脂肪和糖類相對減少），采收期及產地等因素也要注意。
1.2.2前處理
1.2.2.1細胞的破碎
材料選定通常要進行處理。要剔除結締組織及脂肪組織。如不能立即進行實驗，則應冷凍保存。除了提取及胞細外成分，對細胞內及多細胞生物組織中的蛋白質的分離提取均須先將細胞破碎，使其充分釋放到溶液中。不同生物體或同一生物體不同的組織，其細胞破壞難易不一，使用方法也不完全相同。如動物胰、肝、腦組織一般較柔軟，作普通勻漿器磨研即可，肌肉及心組織較韌，需預先絞碎再制成勻槳。
⑴機械方法
主要通過機械切力的作用使組織細胞破壞。常用器械有：①高速組織搗碎機（轉速可達10000rpm，具高速轉動的鋒利的刀片），宜用于動物內臟組織的破碎；②玻璃勻漿器（用兩個磨砂面相互摩擦，將細胞磨碎），適用于少量材料，也可用不銹鋼或硬質塑料等，兩面間隔只有十分之幾毫米，對細胞破碎程度較高速搗碎機高，機械切力對分子破壞較小。小量的也可用乳缽與適當的緩沖劑磨碎提取，也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細。但在磨細時局部往往生熱導致變性或pH 顯著變化，尤其用玻璃粉和氧化鋁時。磨細劑的吸附也可導致損失。
⑵物理方法
主要通過各種物理因素的作用，使組織細胞破碎的方法。
a 反復凍融法
于冷藏庫或干冰反復于零下15～20℃使之凍固，然后緩慢地融解，如此反復操作，使大部分細胞及細胞內顆粒破壞。由于滲透壓的變化，使結合水凍結產生組織的變性，冰片將細胞膜破碎，使蛋白質可溶化，成為粘稠的濃溶液，但脂蛋白凍結變性。
b 冷熱變替法
將材料投入沸水中，于90℃左右維持數分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細胞被破壞。
c 超聲波法
暴露于9～10 千周聲波或10～500 千周超聲波所產生的機械振動，只要有設備該法方便且效果也好，但一次處理量較小。應用超聲波處理時應注意避免溶液中氣泡的存在。處理一些超聲波敏感的蛋白質酶時宜慎重。
d 加壓破碎法
加一定氣壓或水壓也可使細胞破碎。
⑶化學及生物化學方法
a 有機溶媒法
粉碎后的新鮮材料在0℃以下加入5～10 倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破碎細胞膜，破壞蛋白質與脂質的結合。蛋白質一般不變性，被脫脂和脫水成為干燥粉末。用少量乙醚洗，經濾紙干燥，如脫氫酶等可保存數月不失去活性。
b 自溶法
將待破碎的鮮材料在一定pH 和適當的溫度下，利用自身的蛋白酶將細胞破壞，使細胞內含物釋放出來。比較穩定，變性較難，蛋白質不被分解而可溶化。利用該法可從胰臟制取羧肽酶。自體融解時需要時間，需加少量甲苯、氯仿等。應防止細菌污染。于溫室30℃左右較早溶化。自體融解過程中PH 顯著變化，隨時要調節pH。自溶溫度選在0～4℃，因自溶時間較長，不易控制，所以制備活性蛋白質時較少用。
c 酶法
與前述的自體融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去變性蛋白質。但值得提出的是溶菌酶處理時，它能水解構成枯草菌等菌體膜的多糖類。能溶解菌的酶分布很廣。尤其卵白中含量高，而多易結晶化。1g 菌體加1～10mg 溶菌酶， pH6.2～7.01h 內完全溶菌。于生理食鹽水或0.2mol 蔗糖溶液中溶菌，雖失去細胞膜，但原形質沒有脫出。除溶菌酶外，蝸牛酶及纖維素酶也常被選為破壞細菌及植物細胞用。表面活性劑處理較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基吡淀及去氧膽酸鈉等。此外一些細胞膜較脆弱的細胞，可把它們置于水或低滲緩沖劑中透析將細胞脹破。
1.2.2.2細胞器的分離
制備某一種生物大分子需要采用細胞中某一部分的材料，或者為了純化某一特定細胞器上的生物大分子，防止其他細胞組分的干擾，細胞破碎后常將細胞內各組分先行分離，對于制備一些難度較大需求純度較高的生物大分子是有利的。尤其近年來分子生物學、分子遺傳學、遺傳工程等學科和技術的發展，對分布在各種細胞器上的核酸和蛋白質的研究工作日益增多，分離各種細胞器上的各類核酸和特異性蛋白質已成為生物大分子制備工作重要內容之一。各類生物大分子在細胞內的分布是不同的。DNA 幾乎全部集中在細胞核內。RNA 則大部分分布于細胞質。各種酶在細胞內分布也有一定位置。因此制備細胞器上的生物大分子時，預先須對整個細胞結構和各類生物大分子在細胞內分布匹有所了解。
細胞器的分離一般采用差速離心法。細胞經過破碎后，在適當介質中進行差速離心。利用細胞各組分質量大小不同，沉降于離心管內不同區域，分離后即得所需組分。細胞器的分離制備、介質的選擇十分重要。較早使用的介質是生理鹽水。因它容易使亞細胞顆粒發生聚集作用結成塊狀，沉淀分離效果不理想，現一般改用蔗糖、Ficoll（一種蔗糖多聚物）或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。水溶液提取：大部分蛋白質均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質的提取一般以水為主。稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質穩定性好、溶度大，也是提取蛋白質的較常用溶劑。鹽溶液提取：以鹽溶液及緩沖液提取蛋白質進常注意下面幾個因素。
a 鹽濃度
等滲鹽溶液尤以0.02～0.05mol/L 磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用。0.15mol/L 氯化鈉溶液應用也較多。如6-磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1mol/L 碳酸氫鈉液提取等。有時為了螯合某些金屬離子和解離酶分子與其他雜質的靜電結合，也常使用枸櫞酸鈉緩沖液和焦磷酸鈉緩沖液。有些蛋白質在低鹽濃度下濃度低，如脫氧核糖核蛋白質需用1mol/L 以上氯化鈉液提取。總之，只要能溶解在水溶液中而與細胞顆粒結合不太緊密的蛋白質和酶，細胞破碎后選擇適當的鹽濃度及PH，一般是不難提取的。只有某些與細胞顆粒上的脂類物質結合較緊的，需采用有機溶劑或加入表面活性劑處理等方法提取。
b PH 值：
蛋白質提取液的PH 值首先應保證在蛋白質穩定的范圍內，即選擇在偏離等電點兩側。如堿性蛋白質則選在偏酸一側，酸性蛋白質選擇偏堿一側，以增大蛋白質的溶解度，提高提取效果。如細胞色素C 屬堿性蛋白質，常用稀酸提取，肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質，用稀堿提取。某些蛋白質或酶與其分物質結合常以離子鍵形式存在，選擇PH3～6 范圍對于分離提取是有利的。
c 溫度：
多數酶的提取溫度在5℃以下。少數對溫度耐受性較高的蛋白質和酶，可適當提高溫度，使雜蛋白變性分離且也有利于提取和進一步純化。如胃蛋白酶等及許多多肽激素類，選擇37～50℃條件下提取，效果比低溫提取更好。此外提取酶時加入底物或輔酶，改變酶分子表面電荷分布，也能促進提取效果。
d 有機溶劑提取：
有機溶劑提取用于提取蛋白質的實例至今是不多的。但一些和脂結合較牢或分子中非極性側鏈較多的蛋白質，不溶于水、稀鹽或稀堿液中，可用不同比例的有機溶劑提取。從一些粒線體（Mitochondria)及微粒體（Microsome)等含多量脂質物質中提取蛋白質時，采用Morton 的丁醇法效果較好。因丁醇使蛋白質的變性較少，親脂性強，易透入細胞內部，與水也能溶解10%，因此具有脂質與水之間的表面活性作用，可占據蛋白質與脂質的結合點，也阻礙蛋白質與脂質的再結合，使蛋白質在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH 及溫度選擇范圍較廣（pH3～10，溫度-2℃至40℃）。國內用該法曾成功地提取了琥珀酸脫氫酶。丁醇法對提取堿性磷酸脂酶效果也是十分顯著的。胰島素既能溶于稀酸、稀堿又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以60—70%的酸性乙醇提取效果較好，一方面可抑制蛋白質水解酶對胰島素的破壞，同時也達到大量除去雜蛋白的目的。
e 表面活性劑的利用：
對于某些與脂質結合的蛋白質和酶，也有采用表面活性劑如膽酸鹽及十二烷基硫酸鈉等處理。表面活性劑有陰離子型（如脂肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽及膽酸鹽等），陽離子型（如氧化芐烷基二甲基銨等）及非離子型（Triton X-100 、TirtonX-114、吐溫60 及吐溫80）等。非離子型表面活性劑比離子型溫和，不易引起酶失活，使用較多。對于膜結構上的脂蛋白和結構，己廣泛采用膽酸鹽處理，兩者形成復合物，并帶上凈電荷，由于電荷再排斥作用使膜破裂。近年來研究膜蛋白使用表面活性劑的稀溶液提取時，較喜歡用非離子型表面活性劑。
f 對提取物的保護：
在各種細胞中普遍存在著蛋白水解酶，提取時要注意防止由它引起的水解。前面所講的降低提取溫度其目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。多數蛋白水解酶的較適PH 在3～5 或更高些，因在較低PH 條件下可降低蛋白質水解酶引起的破壞程度。低pH可使許多酶的酶原在提取過程中不致激活而保留在酶原狀態，不表現水解活力。加蛋白質水解酶的抑制劑也同樣起保護作用，如以絲氨酸為活性中心的酶加二異丙基氟磷酸，以巰基為中心的酶加對氯汞苯甲酸等。提取溶液中加有機溶劑時也能產生相類似的作用。蛋白水解酶的性質變化很大，上述條件均視具體對象而變化。有一些蛋白含巰基，這些巰基可能是活性所必需。在提取這種蛋白不要帶入金屬離子和氧化劑。前者可往提取液中加金屬螯合劑如EDTA，后者可加入還原劑如抗壞血酸。有某些蛋白質帶一些非共價鍵結合的配基。提取時要注意保護，不要使酸基丟失。